СИСТЕМАТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ГРУППЫ MICROSPORIDIA

Преображенская Ю. А.

Студент 1 курса факультета биоинженерии и биоинформатики,  Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова

СИСТЕМАТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ГРУППЫ MICROSPORIDIA

Аннотация

Данный обзор посвящен анализу группы Microsporodia, направленному на  установление систематического положения данной группы, выяснение филогенетических связей и построение филогенетических деревьев на основе белковых последовательностей, выявление закономерностей эволюции белков, сравнение структур кристаллов белков, поиск консенсусных последовательностей в полученных выравниваниях. Решение данных задач поможет в разработке лекарств от микроспоридиальных инфекций человека и животных (что наносит ежегодно мощный ущерб хозяйству).

Ключевые слова: Microsporidia, эволюция, филогенетика.

Preobrazhenskaya Y. A.

Student, Lomonosov Moscow State University

THE TAXONOMY OF MICROSPORIDIA

Abstract

This review represents the results of the Microsporidian proteome analysis, provides to find out the taxonomy of the group, learning of some phylogenetic correlations, building of evolutionary with protein sequences as the base, studding of the protein evolutionary mechanisms, comparison of the protein sequences, the search for consensus sequences from the alignments. The human diseases provide by microsporidian parasites are becoming more and more common. So if we work out the listed objectives, we could make new special drugs provide healing with a single blow.

Keywords: Microsporidia, enolution, phylogenetics.

В конце XX века в специализированной литературе можно было найти данную группу в составе паразитических протист неясного систематического положения (так как до появления молекулярных методов анализа существовал таксон Fungi, как правило, относимый к Plantae, так же как и Bacteria и Archaea, лишь позже появился отдельный класс Protista). Долгое время предполагалось, что Microsporea являются наиболее прими­тивными эукариотами, поскольку для них характерны такие примитивные (плезиоморфные) признаки, как 70S рибосомы (с 16S и 23 S рРНК), и неко­торые другие прокариотные черты. Жгутики, центриоли и настоящие, со­держащие более трех цистерн, диктиосомы также отсутствуют [1].

 Гипотеза Archezoa (утверждающая, что данный таксон более древний, чем грибы и простисты) была основана на отсутствии митохондрий в исследованиях методами микроскопии. Однако позднее были обнаружены следы митохондрий – пируват-дегидрогеназный комплекс и HSP70; тельца, которые удалось получить, индуцируя экспрессию соответствующих ядерных генов, называют митосомами, некоторые маркерные белки были обнаружены в цитозоле [2]. Также отсутствие копий генов, кодирующих рибосомальные типы РНК, что свойственно для прокариот, но не для эукариот, сбивало с толку. Затем в связи с развитием токсикологии и паразитологии интерес к Microsporidia возрос и чаще стали обращаться к их протеому и геному, однако проблема их классификации стала более очевидной. В начале  2000-х  полноценный обзор показал довольно близкое родство с грибами, была обнаружена консенсусная последовательность, присутствующая только у грибов, животных и архей, был проведен анализ более 20 последовательностей аминокислот.

Это очень мелкие одноклеточные организмы без жгутиков. Диаметр спор варьируется  от 1 до немногим более 20 мкм. Все без исключения микроспо­ридии — внутриклеточные паразиты. Обычно их трофонты свободно лежат в цитоплазме клетки хозяина, но иногда — внутри паразитофорной вакуоли. Всего известно 1200 видов в составе 144 родов. В состав хозяев микроспо­ридий входят как одноклеточные орга­низмы (Apicomplexa, Ciliophora), так и многоклеточные (миксоспоридии, книдарии, плоские черви, нематоды, мшан­ки, кольчатые черви, моллюски, члени­стоногие и позвоночные). В наиболь­шей мере микроспоридии освоили чле­нистоногих и костных рыб. Среди млекопитающих они поражают преиму­щественно грызунов, хищников и неко­торых приматов.

Микроспоридии имеют самый ма­ленький из всех известных ядерный ге­ном, однако плотность генов очень вы­сока [1].

Все представители данной группы попадают в клетку сходным образом – используют характерные структуры – поляропласт, спиральную нить, заднюю вакуоль.

Таким образом, данный анализ проводился с целью попытаться установить систематическое положение Microsporidia, а также поиск гомологов белков-маркеров вышеуказанных структур, что может ускорить процесс создания лекарств  против микроспоридиозов.

Белковые последовательности были получены из базы данных UniProt [3], нуклеотидные последовательности из базы данных EBBL [4]. Мы подбирали последовательности схожей длины, пользуясь алгоритмом поиска гомологов BLAST, а также отбирали вручную. При создании выравниваний использовались средства JalView (алгоритм Muscle для белков и Mafft для нуклеотидных последовательностей) и MEGA6, которая также применялась для построения деревьев методом Neighbor-joining. Для визуализации структур применялись программы PyMol и Jmol.

Анализировались следующие белки:

1. Гистоны H2A
2. ДНК-полимераза
3. ДНК-зависимая РНК-полимераза
4. ГТФаза
5. Глицинил-тРНК-синтетаза
6. EF-1-alpha
7. TF IIB

Данная выборка не случайна: здесь отображены наиболее консервативные белки. Далее приведем анализ каждого филогенетического древа по всем белкам выбранных представителей.

1. УСТАНОВЛЕНИЕ РОДСТВА МЕТОДОМ ПОСТРОЕНИЯ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕРЕВЬЕВ.

Гистон H2A

• Microsporidia – базальная ветвь по отношению к грибам, Metazoa, паразитическим протистам.
• Наиболее близко располагаются к к микроспоридиям Myxomycota.
• Внутри Metazoa наблюдаются разные тенденции.

 

Рис. 1 – Реконструкция филогенетического древа по гистону Н2А. Fungi: Puccinia striiformis f. sp. Tritici, Piriformospora indica, Serpula lacrymans var. lacrymans; Metazoa: Xenopus laevis, Homo sapiens, Caenorhabditis japonica; Placozoa: Trichoplax adhaerens; Excavata: Histomonas meleagridis; Alveolata: Paramecium tetraurelia; Myxomycota: Dictyostelium discoideum; Archaea: Methanocaldococcus jannaschii; Microsporidia: Encephalitozoon cuniculi

  ДНК-полимераза E

• Как можно видеть из древа, ветвь микроспоридий базальна по отношению к Fungi и Archaeplastida, но все же с Fungi последовательность более схожа, чем с ветвью
• Полимеразы “высших” и “низших” растений отличаются в большей степени друг от друга, чем те же белки аскомицетов и базидиомицетов.
• Также можно заметить, что ДНК-полимеразы типа архей и микроспоридий наиболее схожи.

 

Рис. 2 – Реконструкция филогенетического древа по ДНК-полимеразе. Fungi: Ustilago hordei, Mucor ambiguus, Rhizopus microsporus; Metazoa: Homo sapiens, Schistosoma mansoni; Viridiplantae: Arabidopsis thaliana, Volvox carteri f. nagariensis, Chlamydomonas reinhardtii; Archaea: Haloquadratum walsbyi; Microsporidia: Nematocida sp

  Глицинил-тРНК-синтетаза (далее – ГТРС)

• ГТРС грибов и растений имеют общего предка.
• Parabasalia и Archaea сестринские группы, отстоящие от Microspotidia.
• Микроспоридии – базальная ветвь по отношению к грибам и растениям.

 

Рис. 3 – Реконструкция филогенетического древа по глицинил-тРНК-синтетазе. Fungi: Schizosaccharomyces pombe, Talaromyces marneffei; Parabasalia: Giardia intestinalis, Trepomonas sp.; Viridiplantae: Solanum lycopersicum, Liriodendron tulipifera; Archaea: Methanopyrus kandleri; Microsporidia: Encephalitozoon cuniculi

  ДНК-зависимая РНК-полимераза

• Микроспоридии – базальная ветвь по отношению к Fungi, Diplomonadida, Metazoa.
• Микроспоридии и Viridiplantae не имеют общего предка и принадлежат разным эволюционным линиям.
• Diplomonadida – базальная ветвь по отношению к Metazoa и Fungi.
• Микроспоридии наиболее близки к Diplomonadida.

 

Рис. 4 – Реконструкция филогенетического древа по ДНК-зависимой РНК-полимеразе. Fungi: Schizosaccharomyces pombe, Talaromyces marneffei; Parabasalia: Giardia intestinalis, Trepomonas sp.; Viridiplantae: Solanum lycopersicum, Liriodendron tulipifera; Archaea: Methanopyrus kandleri; Microsporidia: Encephalitozoon cuniculi

  ГТФазы

• Микроспоридии – базальная ветвь по отношению к Fungi,Viridiplantae, Metazoa.
• Diplomonadida – базальная ветвь по отношению к микроспоридиям.
• Микроспоридии наиболее близки к грибам и метазоем – базальная ветвь по отношению к Metazoa и Fungi.
• Микроспоридии наиболее близки к Diplomonadida.

 

Рис. 5 – Реконструкция филогенетического древа по ГТФазе. Fungi: Puccinia graminis f. sp. Tritici;  Parabasalia: Giardia intestinalis; Viridiplantae: Solanum lycopersicum, Liriodendron tulipifera; Archaea: Lokiarchaeum sp.; Microsporidia: Pseudoloma neurophili; Diplomonadida: Trichomonas vaginalis; Metazoa: Danio rerio, Homo sapiens; Heterolobosea: Naegleria gruberi, Entamoeba histolytica

  TF-II

• Микроспоридии относятся к одному ответвлению с Fungi.
• Parabasalia базальны по отношению к другим рассматриваемым таксонам.
• Ветвь, включающая грибы и микроспоридии, отстоит далеко от ветви, включающей растения и метазои .
• Parabasalia не являются сестринским таксоном, парафилетической группой, полифилетической группой, базальной группой по отношению с грибам и микроспоридиям.

 

Рис. 6 – Реконструкция филогенетического древа по TF-II. Fungi: Mucor ambiguous, Rhizopus microsporus;  Parabasalia: Giardia intestinalis; Viridiplantae: Glycine max, Arabidopsis thaliana; Archaea: Pyrococcus woesei, Haloferax volcanii; Microsporidia: Encephalitozoon cuniculi; Metazoa: Danio rerio, Homo sapiens

  2. УСТАНОВЛЕНИЕ РОДСТВА С УЧЕТОМ КОНСЕНСУСНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ.

Было высказано предположение, что некая последовательность из 10 нуклеотидов является характерной для грибов, метазоев и микроспоридий.

Сначала зафиксируем наличие или отсутствие последовательности среди организмов выбранных групп.

EF-1-alpha

• Между положениями 210 и 219 у грибов, метазоев и микроспоридий зажата консенсусная последовательность, отсутствующая у растений и архей.
• Наиболее консервативные позиции – 211, 212, 219.
• Parabasalia имеет глицин в 219 позиции

 

Рис. 7 – Фрагмент выравнивания ef-1-alpha, где выделена предполагаемая консервативная последовательность. Подборка организмов с помощью BLAST

 

Затем проверим, встречается ли данная последовательность в других таксонах:

• Между положениями 216 и 229 у грибов, метазоев и микроспоридий зажата консенсусная последовательность.
• У Myxomycota, Parabasalia, Diplomonadida, Archaea, Bacteria, Viridiplantae отсутствует эта последовательность.
• Наблюдается вариабельность в последних трех остатках.

 

Рис. 8 – Фрагмент расширенного выравнивания ef-1-alpha, где выделена предполагаемая консервативная последовательность. Подборка организмов с помощью BLAST.

  3. УСТАНОВЛЕНИЕ РОДСТВА С УЧЕТОМ СТРУКТУРЫ КРИСТАЛЛА.  

Рис. 9 – Структура кристалла ef-1-alpha человека (2), где выделена предполагаемая консервативная последовательность (1). Окраска по вторичной структуре. PDB 1SYW. Показано в Jmol, PyMol

       

        Рис. 10 – Структура кристалла ef-1-alpha Sulfolobus solfataricus (2), где выделен регион с отсутствующей консервативной последовательностью (1). Окраска по вторичной структуре. PDB 1JNY. Показано в Jmol, PyMol

  Различия в структурах:

• У растений вторичная структура представлена более чем одним доменом.
• У архей и растений характерные остатки (K, Y), предшествующие последовательности, заменены на иные
• У архей и грибов 2 цепи, у метазоев и растений – 1.
• У грибов структура представлена более чем 1 доменом.

 

                 

Рис. 11 – Структура кристалла ef-1-alpha Saccharomyces cerevisiae (1) и модель структуры ef-1-alpha  Zea mays (2). Окраска по вторичной структуре. PDB 1F60, Protein Model Portal, Q41803. Показано в PyMol

Безусловно, большинство приведенных результатов (за исключением РНК-полимеразы) свидетельствуют о родстве с Fungi. Однако обсудим сначала несогласующиеся результаты.

Данные по гистонам показывают близкое родство с Myxomycota, относимыми ранее к грибоподобным организмам.

С одной стороны, можно найти на первый взгляд противоречивые данные о вхождении в единый парафилетический таксон с археями (ДНК-полимераза, данные о структурах ef-1-alpha).

Также сбивает с толку вхождение в парафилетический таксон с Diplomonadida  по ГТФазе и РНК-полимеразе.

Проливают свет на эти моменты данные по выравниванию белков TF-II (и соответствующее древо) и поиску организмов, EF-1-alpha которых содержит консенсус. В первом случае очевидно вхождение в один монофилетический таксон с Fungi (родство с Ascomycota и Zygomycota), с учетом высокой консервативности этого белка. Возможное родство со слизевиками опровергает отсутствие у них в EF-1-alpha консенсусной последовательности, характерной лишь для грибов и  метазоев. Наличие 2 цепей EF-1-alpha у грибов (значительно меньше) и архей и наличие лишь 1 у метазоев может свидетельствовать о существовании архаичных черт, присущих грибам или являться результатом случайного сходства, установление чего не входило в рамки исследования.

Таким образом, этим можно объяснить сходство некоторых белковых последовательностей микроспоридий, грибов, парабазалий и дипломонад. Кроме того, быстрая эволюция паразитических протист и микроспоридий внесла определенный вклад в картину понимания.

Литература

1. Hausman K., Hjul'sman H., Radek R. Protistologija: Rukovodstvo Pod red. S.A. Korsuna. Per. s angl. S.A. Karpova. — M.: Tovarishhestvo nauchnyh izdanij KMK, 2010. — 495 s
2. Lynne S. Garcia Laboratory Identification of the Microsporidia// Journal of Clinical Microbiology– June 2002 - vol. 40 no. 6 - 1892-1901
3. UniProt Database [Электронный ресурс]      URL: http://www.uniprot.org/ (дата обращения 21.06.2016).
4. The European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс] URL: http://www.ebi.ac.uk/ (дата обращения 19.06.2016).