КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ IN VITRO, EX VIVO, IN VIVO

Селезнева А.И.¹, Калатанова А.В.², Афонькина О.В.³

¹ Кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, ²младший научный сотрудник, ³младший научный сотрудник, ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации» 

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ IN VITRO, EX VIVO, IN VIVO

Аннотация

В статье рассмотрено – эффективное планирование и варианты проведения экспериментальных исследований с привлечением оптимального спектра методов для установления возможных направлений действия фармакологических веществ in vitro, ex vivo, in vivo. Конечной целью комплексного использования батареи методов является получение достоверных и достаточных по объему экспериментальных данных, сокращение объемов, стоимости и сроков исследования за счет грамотной разработки дизайна исследования и использования данных, полученных на каждом этапе.

Ключевые слова: скрининг, доклинические исследования, лекарственные средства, фармакологическое вещество, эффективность, безопасность, in vitro, ex vivo, in vivo.

  SeleznevaA.I.¹,  KalatanovaA.V.², AfonkinaO.V.³

¹Kandidat Medical Sciences, Senior Researcher, ²Junior Researcher, ³ Junior researcher, "Institute of Pharmacy of Saint-Petersburg"

COMPLEX APPROACH TO STUDY PHARMACOLOGICAL AGENTS IN VITRO, EX VIVO, IN VIVO

Abstract

The article considers effective planning and options for experimental studies involving the optimum range of methods to identify possible areas of action of pharmacological agents in vitro, ex vivo, in vivo. The ultimate goal of the integrated use of a battery of methods to provide a reliable and sufficient in terms of experimental data, reducing the volume, cost and timing of the study by a competent study design and the use of data collected at each stage.

Keywords: screening, pre-clinical studies, drugs, pharmacological agent, the efficiency, safety, in vitro, ex vivo, in vivo.

Успешное изучение эффективности и безопасности фармакологических веществ напрямую зависит от грамотного планирования и разработки дизайна исследования. Существует большое количество методов как скрининговой, так и объемной оценки возможной направленности действия и токсических свойств фармакологических веществ. Эти методы можно условно определить в три группы согласно способам их выполнения – методы in vitro, ex vivo, in vivo.

Методы in vitro подразумевают скрининговую или объемную оценку эффективности и безопасности фармакологических веществ в модельных системах с использованием реакционных сред, ферментов, клеточных линий и др. На сегодняшний день в мировом научном сообществе методы in vitro очень популярны, как с точки зрения высокой инновационности, так и с позиции гуманного обращения с животными. Однако ограничение исследований эффективности и безопасности фармакологических веществ методами  in vitro не целесообразно, так как экстраполяция полученных результатов на целый организм характеризуется высоким риском.

Методы ex vivo представляют собой, как правило, изолированные органы и ткани живых организмов. Эти методы также широко известны, а данные, полученные в результате исследований ex vivo, как правило, характеризуются большей релевантностью клинике. Однако, также как и методы in vitro, результаты исследований ex vivo, не могут являться основанием для начала клинических испытаний фармакологического вещества.

Методы in vivo являются классическими для экспериментальной фармакологии и представляют собой исследования на различных видах и линиях животных. Методы in vivo позволяют получить достоверные и достаточные по объему результаты, которые могут быть с успехом экстраполированы в клинику. Существует большое количество данных об анатомических, физиологических, биохимических и других особенностях видов и линий экспериментальных животных, которые позволяют установить степень релевантности человеку и прогнозировать результаты клинических исследований фармакологических веществ. Однако, не смотря на высокую информативность исследований in vivo, наиболее успешный подход к разработке дизайна исследований может быть обеспечен результатами исследований in vitro и ex vivo. Эти методы также позволяют существенно сократить количество животных в эксперименте, что имеет ключевое значение с точки зрения биоэтики [1,2].

В данной работе определены возможные варианты комплексной оценки эффективности фармакологических веществ с применением батареи методов in vitro, ex vivo и in vivo. Использование комплексного подхода позволяет сделать экспериментальное исследование максимально информативным и достоверным.

Комплексная оценка эффективности фармакологических веществ in vitro, ex vivo и in vivo

Для исследования эффективности фармакологических веществ особенное значение имеет скрининг фармакологической активности, пилотные исследования и изучение механизмов действия. Так, новые фармакологические вещества могут быть синтезированы или получены из природного сырья с использованием различных методов, может быть выделено большое количество стереоизомеров или веществ, отличающихся по структуре на одну или несколько функциональных групп. Проведение полноценного исследования каждого из кандидатов требует больших временных, экономических затрат и использования большого количества животных. Применение методов in vitro и ex vivo в большинстве случаев позволяет выбрать наиболее перспективные кандидаты и сократить объем исследований [3].

Исследование in vivo позволяет получить объемные данные, оптимальные для экстраполяции в клинику. Применение различных моделей заболеваний на животных, а также использование генетически модифицированных видов способствует установлению механизмов фармакологического действия, эффективных доз, динамики значений маркеров патологии при длительном курсовом применении и др.

В качестве примера приведем комплексное исследование эффективности фармакологического вещества Х, потенциально обладающего антиоксидантными и кардиопротективными свойствами, в системе методов in vitro, ex vivo и in vivo.

Дизайн исследования представлен в таблице 1.

Таблица 1 – Дизайн комплексного исследования эффективности фармакологического вещества X

На первом этапе исследования механизмов действия in vitro было установлено, что фармакологическое вещество Х характеризуется выраженной эффективностью в отношении гидроксильного радикала и перекисного окисления липидов (табл. 2).

Таблица 2 – Эффективность фармакологического вещества Х в исследованиях in vitro

Эффективность фармакологического вещества Х превышала таковую препарата сравнения Y.

Установлено, что наличие антиоксидантных свойств фармакологического вещества обусловливает его цитопротекторные свойства [4]. В многочисленных клинических и экспериментальных исследованиях определено, что оксидативный стресс играет ключевую роль в развитии кардиоваскулярных патологий, таких как ИБС, АГ, атеросклероз, коронарная недостаточность и сердечная недостаточность [5,6].

Результаты исследований in vitro позволили определить основные направления экспериментального дизайна ex vivo и in vivo, а также установить возможные механизмы действия фармакологического вещества.

Вторым этапом исследований было определение кардиопротекторных свойств фармакологического вещества Х в эксперименте ex vivo, проведенном на изолированном сердце по методу Лангендорфа [7]. Исследование проводили при применении фармакологического вещества Х в трех дозах.

В результате второго этапа исследований было установлено, что значения показателей давления (LVP) и скорости сокращения (dP/dt max) левого желудочка на фоне ишемии с последующей реперфузией изолированного сердца статистически значимо увеличиваются, что может свидетельствовать о положительном инотропном действии препарата (рис. 1).

Рис. 1 – Эффективность фармакологического вещества Х в исследовании ex vivo.

Данные, полученные в исследовании in vitro и ex vivo, дают основание предполагать ключевой механизм действия и фармакологический эффект вещества, а, следовательно, планировать эксперименты  in vivo.

Таким образом, так как in vitro и ex vivo фармакологическое вещество X характеризовалось выраженной кардиопротекторной активностью, а также влиянием на антиоксидантную систему, то для изучения специфической активности in vivo были выбраны модели сердечно-сосудистых патологий, патогенез которых связан с оксидативным стрессом и нарушением сократимости миокарда: острый инфаркт миокарда и артериальная гипертензия.

В результате исследований эффективности фармакологического вещества Х in vivo на модели острого инфаркта миокарда было установлено влияние на физиологические и биохимические параметры моделируемой патологии (табл. 3).

Таблица 3 – Эффективность фармакологического вещества Х на фоне моделирования острого инфаркта миокарда у крыс, M ± m.

Примечание - * p ‹ 0,05 в сравнении контрольной группой

В результате исследований эффективности фармакологического вещества Х in vivo у спонтанно-гипертензивных крыс наблюдали выраженное снижение систолического (САД) и диастолического (ДАД) артериального давления как до применения фармакологического вещества Х, так и через 1 час после (табл. 4).

Таблица 4 - Изменение АД при курсовом применении фармакологического вещества Х

Примечание - * p ‹ 0,05 в сравнении контрольной группой

Таким образом, в результате использования комплексной оценки in vitro, ex vivo и in vivo была установлена высокая эффективность нового фармакологического вещества Х и определены возможные механизмы действия. На модели изолированного сердца по методу Лангендорфа и при моделировании острого экспериментального инфаркта миокарда in vivo было установлено кардиотоническое и кардиопротективное действие препарата. При применении нового препарата у спонтанно-гипертензивных животных наблюдалось стойкое снижение АД, а также уменьшение цифр исходного давления к концу курса лечения. Было установлено, что ключевую роль в реализации фармакологических эффектов фармакологического вещества Х играет его антиоксидантная активность, что было подтверждено в исследованиях антирадикальной и восстанавливающей способности in vitro.

Использование методов in vitro и ex vivo позволило существенно сократить объем экспериментальных животных, так как на основании их результатов были выбраны эффективные дозы фармакологического вещества Х и наиболее подходящие экспериментальные модели.

Литература

1. Russell W.M.S., Burch, R.L. The Principles of Humane Experimental Technique. – London: Methuen & Co. 238 pp.;
2. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes // Official Journal of the European Union. 2010. P. 33 – 79;
3. Humane Science in the 21st Century: abstracts of the 9th World Congress, Prague, 2014. Volume 3, No. 1. 336 pp.;
4. Mathers J. Antioxidant and cytoprotective responses to redox stress // Biochem Soc Symp.- Vol. 71. - P.157-176;
5. Addabbo F. Mitochondria and Reactive Oxygen Species / F. Addabbo, M. Montagnani, M.S. Goligorsky // Hypertension. - 2009. 53. - P. 885-892;
6. Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. - Новосибирск: АРТА, 2008. 284 с;
7. Торопова Я.Г.  Перфузия изолированного сердца методом Лангендорф и Нилли: возможности применения в научных исследованиях / Я.Г. Торопова, Н.Ю. Осяев, Р.А. Мухамадияров // Трансляционная медицина. – 2014. № 4 – С. 34-39.

References

1. Russell W.M.S., Burch, R.L. The Principles of Humane Experimental Technique. – London: Methuen & Co. 238 pp.;
2. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes // Official Journal of the European Union. 2010. P. 33 – 79;
3. Humane Science in the 21st Century: abstracts of the 9th World Congress, Prague, 2014. Volume 3, No. 1. 336 pp.;
4. Mathers J. Antioxidant and cytoprotective responses to redox stress // Biochem Soc Symp.- Vol. 71. - P.157-176;
5. Addabbo F. Mitochondria and Reactive Oxygen Species / F. Addabbo, M. Montagnani, M.S. Goligorsky // Hypertension. - 2009. 53. - P. 885-892;
6. Men'shhikova E.B. Okislitel'nyj stress: Patologicheskie sostojanija i zabolevanija. - Novosibirsk: ARTA, 2008. 284 s;
7. Toropova Ja.G. Perfuzija izolirovannogo serdca metodom Langendorf i Nilli: vozmozhnosti primenenija v nauchnyh issledovanijah / Ja.G. Toropova, N.Ju. Osjaev, R.A. Muhamadijarov // Transljacionnaja medicina. – 2014. № 4 – S. 34-39.