Pages Navigation Menu

ISSN 2227-6017 (ONLINE), ISSN 2303-9868 (PRINT), DOI: 10.18454/IRJ.2227-6017
ПИ № ФС 77 - 51217

DOI: https://doi.org/10.18454/IRJ.2016.48.218

Скачать PDF ( ) Страницы: 78-79 Выпуск: № 6 (48) Часть 5 () Искать в Google Scholar
Цитировать

Цитировать

Электронная ссылка | Печатная ссылка

Скопируйте отформатированную библиографическую ссылку через буфер обмена или перейдите по одной из ссылок для импорта в Менеджер библиографий.
Лопатина А. Б. МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК / А. Б. Лопатина // Международный научно-исследовательский журнал. — 2016. — № 6 (48) Часть 5. — С. 78—79. — URL: http://research-journal.org/chemistry/metod-issledovaniya-dnk/ (дата обращения: 26.04.2017. ). doi: 10.18454/IRJ.2016.48.218
Лопатина А. Б. МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК / А. Б. Лопатина // Международный научно-исследовательский журнал. — 2016. — № 6 (48) Часть 5. — С. 78—79. doi: 10.18454/IRJ.2016.48.218

Импортировать


МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК

Лопатина А.Б.

Кандидат педагогических наук, Пермский национальный исследовательский политехнический университет

МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК

Аннотация

Данная работа посвящена описанию методов изучения ДНК и химических реакций, протекающих в клетках бактерий. Успехи современной науки огромны, но даже при таком прогрессивном изучении молекулярных и субмолекулярных процессов, процессы самовосстановления, саморегуляции и репарации ДНК, превосходят все ожидания. Представлено описание метода изучения ДНК посредством проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), что базируется на естественных для самой молекулы ДНК процессах комплементарности и репарации.

Ключевые слова: ДНК, репарация, ПЦР.

Lopatina A.B.

PhD in Pedagogy, Perm National Research Polytechnic University

RESEARCH METHOD DNA

Abstract

This work is devoted to description of methods for studying DNA and chemical reactions in the cells of the bacteria. The success of modern science are enormous, but even with such a progressive study of molecular and submolecular processes, self-healing processes of self-regulation and DNA repair, surpass all expectations. The description of the method of studying the DNA by polymerase chain reaction (PCR), which is based on natural for most molecules of DNA repair processes and complementarity.

Keywords: DNA, repair, PCR.

Введение.

Помимо известной способности ДНК к самовосстановлению в ее арсенале есть механизмы, такие как рекомбинационная репарация, при которых для воссоздания изначальной цепочки, следующих друг ха другом нуклеотидов, основой служит аналог из второй хромосомы. Возможно так же и соединение несоответствующих друг другу окончаний молекулы ДНК. Хотя при этом часть ее утрачивается, что не является критичным, поскольку эти участки не несут в себе зашифрованной информации. Эти репарационные способности применяются в тех случаях, когда необходимо устранить разрыв обеих цепочек ДНК. Механизмы устойчивости к повреждению, при которых сохраняется способность клетки сохранять жизнеспособность и функционировать, также имеют место быть, не беря во внимание факт нарушения ее геномного аппарата. Также известны механизмы, которые позволяют продолжать жизнедеятельность клетки при нарушении структуры или полном разрушении ДНК, что заложено в структуре ДНК для самоорганизации и самовосстановления [1].

Целью данной публикации является изложение базовых понятий, служащих основой для реализации химической реакции полимеразной цепной реакции (ПЦР), значительно известным и применяемым способом исследования ДНК.

Организация ДНК являет собой сложную структуру длинной нитевидной молекулы, содержащей в себе две простроенные в цепи последовательности нуклеотидов, закрученные спиралевидно вокруг оси. Каждая цепь ДНК состоит из большого количества соединенных друг с другом мономерных звеньев – дезоксирибонуклеотидов четырех разных типов: аденозина, гуанозина, тимидина, цитидина. Эти мономеры образуют характерные для каждого организма специфические последовательности. Дезоксирибонуклеотиды состоят из трех компонентов: азотистого основания (производного пурина или пиримидина), сахара дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты. Остатки фосфорной кислоты выполняют структурную роль, образуя сахарофосфатный остов молекулы ДНК. 3’ОН – группы дезоксирибозы одного нуклеотида связаны фосфодиэфирной связью с 5’ОН – группы другого соседнего нуклеотида. Поэтому цепь ДНК обладает полярностью, имеет 3’и 5’конец. Азотистые основания несут собственно генетическую информацию. Аденин образует две водородные связи с тимином, а гуанин образует две водородные связи с цитозином. Эта закономерность лежит в основе принципа комплементраного спаривания оснований. Аденин всегда связывается с тимином, а гуанин всегда связывается с цитозином.

Структуры ДНК стабилизированы благодаря созданию водородных связей между соответствующими друг другу основаниями, расположенными дуэтами. При увеличении температуры до 80-90 градусов или изменении рН, происходит разрушение водородных связей, что ведет к денатурации молекулы ДНК. При снижении температуры и при введении значений рН к нейтральным, расплетенная цепь ДНК самопроизвольно сплетается, образуя исходную двойную спираль. Этот процесс называется ренатурацией.

В основании способа ПЦР заложен механизм самовосстановления ДНК, делящийся на три стадии. Первая стадия – денатурация, расплетение двойной спирали и расхождение нитей. Вторая — образование коротких двухцепочечных участков ДНК, которые служат затравками для синтеза новых цепей. Третья – удлинение обеих цепей затравок, в результате комплиментарного достраивания в направлении от 5′ к 3’концу молекулы ДНК. Материалом для достраивания служит дезоксинуклеотидтрифосфаты. Ускорение этой реакции происходит при участии ДНК-полимеразы, которая катализирует последовательное присоединение дезоксирибонуклеотидных остатков к цепи затравки со свободной 3’ОН–группой.  Сначала формируются водородные связи между соответствующими другу дуэтами азотистых оснований, а затем образуется фосфодиэфирная связь между остатками рибозы. В итоге этого процесса образуется новая цепь ДНК, полностью соответствующая исходной матричной цепи.

ПЦР является способом определения короткого специфического участка ДНК, при котором полинуклеотидные затравки – праймеры, комплементарные границам короткого специфического участка ДНК, используются в процессе естественной репликации. После множественного повтора репликации, осуществляется кумуляция участков ДНК строго определенной длины, которые можно достоверно идентифицировать. Процесс накопления участков называется амплификацией. В каждом периоде амплификации происходит удвоение числа копий искомого фрагмента ДНК, то есть накопление фрагментов происходит по экспоненциальному закону и за 30–40 периодов амплификации в растворе накапливается до 108 молекул фрагментов ДНК. Чтобы осуществить всю последовательность химических реакций для этого исследования требуются определенные составляющие: ДНК–матрица, олигонуклеотидные затравки, праймеры, комплементарные границам участка молекулы ДНК, дезоксинуклеотид трифосфат и фермент ДНК–полимераза. Процесс осуществляется в определенном буфере, обеспечивающем оптимальные условия для ее проведения. Каждый период амплификации состоит из трех подприодов с различными температурными режимами.  На первой стадии при 93 – 95° С в течение 30–40 секунд происходит денатурация исходной матричной ДНК. На второй — при 50–65°С комплементарное присоединение, отжиг (за 20-60 секунд) праймеров к соответствующим последовательностям на границе специфического участка. Третья стадия проводится при температуре оптимальной активности фермента ДНК–полимеразы 70-72°С, когда осуществляется достраивание цепей праймеров. В современной методике проведения ПЦР используется термоустойчивая бактериальная ДНК–полимераза, которая значительное нагревание, что избавляет от необходимости добавлять новую ее порцию в каждом новом цикле амплификации.  После завершения первого периода мплификации в растворе находится двухцепочечная молекула ДНК, состоящая из одной материнской цепи и одной новой синтезированной цепи, ограниченной с одной стороны праймером [5].

Во втором периоде амплификации, состоящем из трех стадий, денатурацию, отжиг праймеров и синтез новых цепей, образуются двухцепочечные молекулы, состоящие из матричной цепи, частично ограниченной цепи и коротких фрагментов ДНК, ограниченных праймерами с двух сторон. Эти короткие фрагменты называются ампликонами. Во всех последующих периодах все новые синтезированные цепи могут служить матрицами для синтеза новых молекул.

С третьего периода амплификации в растворе накапливаются короткие ампликоны. Процесс амплификации проводится в специально программируемом амплификаторе, который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур и временных интервалов. Обычно процесс амплификации включает 30–40 периодов. За это время расходуются некоторые исходные компоненты реакций, а в растворе накапливается до 108 молекул ампликонов. Этого количества достаточно для достоверной детекции фрагментов методом электрофореза в агарозном геле.

Заключение: используя натуральные механизмы, содержащиеся в ДНК, стало возможным применять способность ДНК к репарации с целью проведения диагностических мероприятий, что стало химической основой проведения ПЦР, широко использующейся для ДНК детекции.

Литература

  1. Сетлоу Р. Молекулярная биофизика. –М.: Мир, 1964. -440 с.

References

  1. Setlou R. Molekulyarnaya biofizika. –M.: Mir, 1964. 440 s.

Оставить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Лимит времени истёк. Пожалуйста, перезагрузите CAPTCHA.