ОПТИМИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS – ПРОДУЦЕНТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ РАПАМИЦИНА

Савельева В.В.¹, Джавахия В.В.², Глаголева Е.В.³, Глаголев В.И.⁴, Савушкин В.А.⁵

¹аспирант, младший научный сотрудник, ²кандидат биологических наук, заведующий лабораторией, ³инженер, ⁴инженер, ⁵инженер, Федеральное государственное учреждение Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

ОПТИМИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS – ПРОДУЦЕНТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ РАПАМИЦИНА

Аннотация

Рапамицин является продуктом метаболизма актиномицета S. hygroscopicus и представляет собой азотсодержащий макролид. В настоящее время рапамицин и его производные имеют широкое клиническое применение в качестве противоопухолевых и иммуносупрессивных агентов.

В данном исследовании проводилась оптимизация питательной среды для штамма S. hygroscopicus R 33-41 при помощи метода математического планирования эксперимента. Оптимизация ферментационной среды совмещала в себе планирование полного факторного эксперимента (ПФЭ 23) с методами крутого восхождения и движения по градиенту концентрации. Параметр оптимизации – количество целевого вещества (рапамицина) по окончанию культивирования. Применение данного метода позволило повысить выход рапамицина на 24,7%.

Ключевые слова: Streptomyces hygroscopicus, рапамицин, питательная среда, оптимизация.

Saveleva V.V.¹, DzhavakhiyaV.V.², Glagoleva E.V.³, Glagolev V.I.⁴, Savushkin V.A.⁵

¹Postgraduate student, Junior Researcher, ²PhD in Biology, ³Engineer, ⁴Engineer, ⁵Engineer, Federal Research Centre «Fundamentals of Biotechnology», Russian Academy of Sciences

NUTRIENT MEDIUM OPTIMIZATION FOR STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS, A PRODUCER OF RAPAMYCIN PHARMACEUTICAL SUBSTANCE

Abstract

Rapamycin is a nitrogen-containing macrolide produced by Streptomyces hygroscopicus. Today rapamycin and its derivatives are widely used as anti-tumor and immunosuppressive agents. In this study the nutrient medium for S. hygroscopicus R 33-41 strain was optimized using design-of-experiments methodology. The performed medium optimization combined the planning of a full factorial design (FFD 2³) with the steepest ascent method and movement along concentration gradient. The amount of a target substance (rapamycin) to the end of fermentation was chosen as the optimization parameter. The application of this method provided a 24.7% increase in the rapamycin output.

Keywords: Streptomyces hygroscopicus, rapamycin, nutrient medium, optimization.

Введение

Со времен открытия стрептомицина в 1943 году [1, C.103-105], было показано, что стрептомицеты (лат. Streptomyces) образуют тысячи соединений (антибиотики, иммуносуппрессанты, противоопухолевые вещества и др.), обладающих большим потенциалом использования в различных отраслях жизнедеятельности человека. Метаболиты, образующиеся в процессе жизнедеятельности актиномицетов, составляют около 2/3 от всех известных антибиотических веществ [2]. Одним из наиболее важных веществ, синтезируемых стрептомицетами, является рапамицин – ингибитор mTOR (от англ. mammalian target of rapamycin), и после циклоспорина, наиболее широко используемый иммуносуппресант микробиологического происхождения [3, C.102-108].

Несмотря на значимость использования и широкий спектр возможностей применения рапамицина в медицине, его получение ограничивается низкой продуцирующей способностью природных штаммов (например, S. hygroscopicus AY-BI1206 [4, C. 436-439], S. hygroscopicus NRRL 5491 [5, C. 727-732]), что увеличивает себестоимость субстанции и снижает возможные объемы его промышленного производства.

Оптимизация питательной среды является главным фактором в повышении выхода продукта, поскольку образование антибиотических веществ регулируется в основном условиями культивирования микроорганизмов [6, C. 56-102]. Традиционно состав питательной среды, оптимальной для выращивания продуцентов, определялся методом длительного эмпирического подбора, в ходе которого устанавливается качественный и количественный состав среды [7, C. 19-23], [8], [9]. В настоящее время при оптимизации питательных сред для микроорганизмов все шире используют математический метод планирования экспериментов, что позволяет обоснованно подходить к конструированию питательных сред, делать их более экономичными [10, C. 111-130]. Планирование эксперимента позволяет варьировать одновременно все факторы и получать количественные оценки, как основных факторов, так и эффектов взаимодействия между ними, причем получаемые результаты характеризуются меньшей ошибкой, чем традиционные методы однофакторного исследования [11], [12, C. 332-344],[13, C. 424-429].

В связи с этим, задачей данного исследования был подбор оптимального состава питательной среды для штамма S. hygroscopicus R 33-41 на основе полного факторного эксперимента с применением методов крутого восхождения и движения по градиенту концентраций для увеличения выхода рапамицина.

Материалы и методы

Штамм-продуцент

В работе использовали штамм Streptomyces hygroscopicus R 33-41, полученный ранее [14, C.122-124], [15, C. 18-19] при помощи мутагенного воздействия на типовой штамм Streptomyces hygroscopicus АТСС 29253. Продуктивность штамма R 33-41 составляла 937 мг/л рапамицина в культуральной жидкости.

Культивирование S. hygroscopicus

Для выращивания, поддержания, хранения культуры S. hygroscopicus использовали плотную агаризованную среду R1 следующего состава (г/л): агар-агар – 20.0, соевая мука – 1.0, растворимый крахмал – 10.0, сульфат магния – 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный – 0.5, дистиллированная вода - до 1 л. Значение активной кислотности среды (pH) до стерилизации составляло 6.8±0.1. Штаммы культивировали при температуре 29 ⁰С в течение 10-12 суток. Для поддержания культуры проводили периодические пересевы на свежую агаризованную среду. Для длительного хранения культуру лиофилизировали и хранили в запаянных ампулах в холодильнике.

Глубинное культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 50 мл, содержащих 10 мл питательной среды. Культуру выращивали в колбах на качалочной установке “Innova 44” при 250 об/мин (эксцентриситет 5 см) и температуре 29⁰С в течение 9 суток. В качестве питательной среды использовали ранее модифицированную [14] среду F2 следующего состава (г/л): соевая мука (полножировая) – 30.0, лизин – 15.0, дрожжевой экстракт – 5.0, соевой пептон – 5.0, глюкоза – 100.0, хлорид натрия – 5.0, сульфат магния – 1.0, сульфат аммония – 1.0, натрий фосфорнокислый 2-замещенный – 5.0, вода дистиллированная до 1 л (рН 6.8-6.9). Глюкозу вносили в среду после стерилизации, в виде 50% раствора.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Количественное определение рапамицина в культуральной жидкости проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1200 Series (Agilent, США) с использованием колонки Agilent Zorbax SB-C18 250мм×4,6мм (сорбент – октадецилсиликагель, 5мкм; мобильная фаза – 75 объемов ацетонитрила и 25 объемов воды; температура колонки - 60ºC; скорость потока 1 мл/мин). В качестве контроля для сравнения использовали стандартный образец рапамицина (R0395 SIGMA, чистота более 95%), предварительно растворенный в метаноле. Объем пробы составлял 10 мкл. Спектрофотометрическую детекцию проводили при λ=278 нм. Время удерживания пика рапамицина составляет 9 минут.

Результаты

Осуществлен полный факторный эксперимент (ПФЭ 2³) с использованием метода крутого восхождения, позволяющий реализовать все возможные комбинации основных уровней независимых переменных факторов, установить оптимальные концентрации компонентов питательной среды с учетом их совместного влияния на выход рапамицина, найти и обосновать оптимальный состав среды. Параметром оптимизации являлась концентрация рапамицина (Y) в культуральной жидкости по окончанию культивирования

Ранее [14, C. 122-124] был проведен ряд отсеивающих экспериментов, основанный на использовании однофакторного метода, по подбору регуляторных компонентов питательной среды, оказывающих максимальное влияние на синтез рапамицина. Основываясь на данные из литературных источников [16, C. 949-969], [17, C. 829-840], [18, C.523-531] и ряд проведенных однофакторных экспериментов была установлена группа сильнодействующих факторов и их активные уровни. На основании этого, в данной работе в качестве факторов варьирования Х₁, Х₂ и Х₃ взяты соевая мука, лизин и глюкоза соответственно, как наиболее значимые компоненты. Кроме того, был использован дополнительный нулевой фактор Х₀ (Х₀=1). Интервалы варьирования факторов составили 5; 5 и 10 г/л соответственно (Таблица 1). Содержание остальных компонентов в питательной среде оставалось неизменным на определенном ранее уровне.

Таблица 1 - Значение факторов в натуральных переменных, шаг варьирования и концентрации основных компонентов питательной среды

Таблица 2 - Матрица планирования эксперимента для ПФЭ типа 2³

Коэффициенты уравнения регрессии, а также коэффициенты двойного и тройного взаимодействия факторов определялись по методу наименьших квадратов в соответствии с данными, полученными при глубинном культивировании штамма S. hygroscopicus R 33-41 в трех повторностях на всех вариантах питательных сред. Этот метод является одним из наиболее распространенных приемов статистической обработки экспериментальных данных, относящихся к различным функциональным зависимостям физических величин друг от друга [19, C. 23-35]. Любой коэффициент уравнения регрессии определяется скалярным произведением столбца Y на соответствующий столбец, отнесенным к числу опытов в матрице планирования N:

где b_i – коэффициент регрессии; x_iu – значение переменной в соответствующем столбце; m – количество повторностей; u = 1, 2…N, k = 1, 2…m; i – номер фактора.

Полученные линейные коэффициенты и коэффициенты парного взаимодействия соответственно равны: b₀=0.80, b₁= 0.08, b₂= 0.03, b₃=-0.13, b₁₂=0.01, b₁₃=-0.03, b₂₃=-0.02, b₁₂₃= -0.01.

Коэффициенты, вычисленные по результатам эксперимента, указывают на силу влияния факторов. Чем больше численное значение коэффициента, тем больше фактор влияет на параметр оптимизации [20, C. 80-92].

Значимость коэффициентов регрессии проверяли по критерию Стьюдента, согласно общепринятой методике [19, C. 30],[21, C.25-30].

Полученное уравнение регрессии имело следующий вид:

У = 0,8+0,08X₁ + 0,03X₂–0,13Х₃+0.01X₁X₂-0.03X₁X₃-0.02X₂X₃-0.01X₁X₂X₃

Проверка адекватности уравнения с использованием F-критерия Фишера [22, C.20-28] показала, что уравнение адекватно описывает процесс.

Построение кривых поверхности отклика показало, что каждый из выбранных нами факторов в той или иной степени влияет на биосинтез рапамицина и, следовательно, является значимым. Кривые поверхности отклика представлены на рисунке 1

Рис.1 - Кривые поверхности отклика, показывающие влияние каждого фактора на биосинтез рапамицина (а)Х₁=1; б)Х₂=1; в)Х₃=1)

На основании результатов проведенного ПФЭ можно предположить, что для дальнейшей оптимизации среды применение метода крутого восхождения будет эффективным, так как полученная линейная модель адекватна и не является резко асимметричной относительно коэффициентов. Для определения оптимального состава питательной среды использовали стандартную методику крутого восхождения Бокса-Уилсона [23]. Полученные данные представлены в таблице.

Таблица 3 - Расчет коэффициентов регрессии и шага варьирования для определения оптимального состава питательной среды по методу крутого восхождения

Таблица 4 - Матрица планирования эксперимента по методу крутого восхождения

В результате осуществления экспериментов методом крутого восхождения в опыте № 4 был достигнут максимальный выход целевого вещества (1,21 г/л), дальнейшее проведение экспериментов методом движения по градиенту концентрации имело негативное влияние на биосинтез рапамицина.

Выводы

На основании проведенных исследований можно заключить, что оптимизация ферментационной среды для штамма S. hygroscopicus R 33-41, совмещающая планирование полного факторного эксперимента (ПФЭ 2³) с методом крутого восхождения и методом движения по градиенту концентрации, в данном случае является эффективной, поскольку конечный выход рапамицина был увеличен относительно исходного значения на 24,7%. В результате эксперимента по методу крутого восхождения разработана ферментационная среда следующего состава (г/л): соевая мука (полножировая) – 36.2, лизин – 20.4, дрожжевой экстракт – 5.0, соевый пептон – 5.0, глюкоза – 85.2, хлорид натрия – 5.0, сульфат магния – 1.0, сульфат аммония – 1.0, натрий фосфорнокислый 2-замещенный – 5.0.

Список литературы / References

1. Jones D. Control of Gramnegative bacteria in experimental animals by streptomycin /Jones D., Metzger H.J., Schatz A., Waksman S.A.// Science. - 1944. – Vol. 100. – P.103-105.
2. Hopwood D.A. Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. Oxford University Press. – NY. – 2007.
3. Trevillian P. Immunosuppressants: clinical applications. Aust Prescr. – Vol. 29. – P.102–108.
4. Kojima I. Carbon source nutrition of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus. /Kojima I., Cheng Y.R., Mohan V. and Demain A.L. //Journal of Industrial Microbiology. - 2006. – Vol.14. – P.436-439.
5. Sehgal S.N. Rapamycin (AY-22, 989), a new antifungial antibiotic II. Fermentation, isolation and characterization. / Sehgal S.N., Baker H., Vezina C.// Journal of Antibiotics. - 1975. – Vol. 28. – P.727-732.
6. Егорова Т.А. Основы биотехнологии: учеб. Пособие / Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.М. // М: Академия. - 2006. – 207c.
7. Осипов Д.С. Математическая модель биосинтеза L-лейцина./ Осипов Д.С., Гусельникова Т.В. //М: МГУИЭ - 2001. - Т№5. – C.19–23.
8. Монтгомери Д. К. Планирование эксперимента и анализ данных./ Монтгомери Д. К., Л.: Судостроение. -1980. – 384c.
9. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. / Перт С.Д., М.: Мир. - 1978. – 331c.
10. Арзамасцев А.А. Математические модели кинетики микробного синтеза: возможности использования и новые подходы к разработке /Арзамасцев А.А., Андреев А.А.// Вестник Тамбовского университета. - 2000. – №5 (1). - С.111–130.
11. Бирюков В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / Бирюков В.В. Кантере В.М. // М: Наука. - 1985. – 296c.
12. Bajpai R.K. Mechanistic model for penicillin production. / Bajpai R.K., Reuss M. A J.// Chem. Technol. and Biotechnol. - 1980. – Vol. 30. – P.332–344.
13. Ettler P. Determination of the optimal feeding regime during biosynthesis of erythromycin/ Ettler P. Votruba J. // Folia Microbiol. - 1980. Vol-25. – P.424-429.
14. Савельева В.В. Разработка высокоактивного штамма Streptomyces hygroscopicus – продуцента фармацевтической субстанции рапамицина. / Воинова Т.М., Глаголева Е.В., Джавахия В.В.// Сборник тезисов XI Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». - 2016. – С.122-124.
15. Савельева В.В. Создание высокоактивного штамма S. hygroscopicus - продуцента фармацевтической субстанции рапамицина, методом индуцированного ненаправленного мутагенеза. Russian Agricultural Science Review. - 2015. -№6 (6-2). – С.18-19.
16. Wang B.Comparative metabolic profiling reveals the key role of amino acids metabolism in the Rapamycin overproduction by Streptomyces hygroscopicus /Wang B., Liu J., Liu H., Huang D. and others// Systems Biotechnology. – 2015. - Vol. 24. – P.949-963.
17. Sinha R. Studies on process optimization methods for rapamycin production using Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 /Sinha R., Singh S., Srivastava P.// Bioprocess Biosyst Eng. - 2014. - Vol.37. – P.829-840.
18. Dutta S. Kinetics of rapamycin production by Streptomyces hygroscopicus MTCC 4003 / Dutta S., Basak B., Bhunia B., Chakraborty S. and others// Biotechnology. - 2014. – Vol.4. - 523-531.
19. Яворский В.А. Планирование научного эксперимента и обработка экспериментальных данных. /Яворский В.А.. М: Издательство МФТИ. - 2006.
20. Адлер Ю.П. Планирование экспериментов при поиске оптимальных условий. / Адлер Ю.П. М: Наука. - 1976. – С.80-92.
21. Хамханов К.М. Основы планирования эксперимента. / Хамханов К.М. Методическое пособие. Издательство: ВСГУТУ. - 2001. – 94с.
22. Жерносекова И.В. Методы планирования экспериментов при оптимизации питательной среды для стрептомицета. /Жерносекова И.В., Черногор Н.П., Тымчук А.А. Вестник Днепропетровского университета. - 2006. – №18 (1). – С.20-28.
23. Бочкарев В.В., Троян А.А. Оптимизация химико-технологических процессов. Практикум. Издательство ТПУ. - 2016. -160с.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Jones D. Control of Gramnegative bacteria in experimental animals by streptomycin /Jones D., Metzger H.J., Schatz A., Waksman S.A.// Science. - 1944. – Vol. 100. – P.103-105.
2. Hopwood D.A. Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. Oxford University Press. – NY. – 2007.
3. Trevillian P. Immunosuppressants: clinical applications. Aust Prescr. – Vol. 29. – P.102–108.
4. Kojima I. Carbon source nutrition of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus. /Kojima I., Cheng Y.R., Mohan V. and Demain A.L. //Journal of Industrial Microbiology. - 2006. – Vol.14. – P.436-439.
5. Sehgal S.N. Rapamycin (AY-22, 989), a new antifungial antibiotic II. Fermentation, isolation and characterization. / Sehgal S.N., Baker H., Vezina C.// Journal of Antibiotics. - 1975. – Vol. 28. – P.727-732.
6. Egorova T.A. Osnovy biotehnologii: ucheb. Posobie [Fundamentals of Biotechnology: A Training Manual]. /Egorova T.A., Klunova S.M., Zhivuhina E.M. // M: Acadimija. - 2006. – 207p. [in Russian]
7. Osipov D.S. Matematicheskaja model’ biosinteza L-leicina [Mathematical model of L-leucine biosynthesis]. / Osipov D.S., Gusel’nikova T.V.// M: MGUIE. - 2001. - № – P.19-23. [in Russian]
8. Montgomerj D.K. Planirovanie eksperimenta i analiz dannych [Experimental Design and Analysis]. / Montgomerj D.K. //L: Sudostroenie. - 1980. - 384. [in Russian]
9. Pert S.D. Osnovy cul’tivirovanija mikroorganizmov i kletok [Basics of microorganisms and cells cultivation]. / Pert S.D. //M: Mir. - 1938. – 331p. [in Russian]
10. Arzamascev A.A. Matematicheskie modelj mikrobnogo sinteza: vozmozhnostj ispol’zovanija i novye podhody k razrabotke [Mathematical models of the kinetics of microbial synthesis: the possibility of using new approaches to development]. / Arzamascev A.A., Andreev A.A. // Vestnik Tambovskogo universiteta [Bulletin Tambovksogo University]. - 2000. -№18 (1). – P.111-130. [in Russian]
11. Birjukov V.V. Optimizacija periodicheskich processov mikrobiologicheskogo sinteza [Optimization of batch processes of microbiological synthesis]. /Birjukov V.V., Kantere V.M. // M: Nauka. - 1985. – 296p. [in Russian]
12. Bajpai R.K. Mechanistic model for penicillin production. / Bajpai R.K., Reuss M. A J.// Chem. Technol. and Biotechnol. - 1980. – Vol. 30. – P.332–344.
13. Ettler P. Determination of the optimal feeding regime during biosynthesis of erythromycin/ Ettler P. Votruba J. // Folia Microbiol. - 1980. Vol. - 25. – P.424-429.
14. Savel’eva V.V. Razrabotka vysokoaktivnogo shtamma Streptomyces hygroscopicus – producenta pharmacevticheskoi substancij rapamicina [The development of a highly active strain of Streptomyces hygroscopicus - producing pharmaceutical substance rapamycin]. /Savel’eva V.V., Voinova T.M., Glagoleva E.V., Dzhavahiya V.V// Sbornik tezisov Molodjozhnoi shkoly – konpherencij s mezhdunarodnym uchastiem “Actual’nye aspect sovremennoi mikrobiologij” [Abstracts of XI Youth school conference with international participation "Actual aspects of modern microbiology”]. - 2016. –P.122-124. [in Russian]
15. Savel’eva V.V. Sozdanie vysokoaktivnogo shtamma hygroscopicus - producenta pharmacevticheskoi substancij rapamicina metodom inducirovannogo nenapravlennogo mutageneza [Creating a highly active strain of S. hygroscopicus - producing pharmaceutical substance rapamycin, induced by non-directed mutagenesis]. Russian Agricultural Science Review. - 2015. - №6 (6-2). – P.18-19. [in Russian]
16. Wang B.Comparative metabolic profiling reveals the key role of amino acids metabolism in the Rapamycin overproduction by Streptomyces hygroscopicus /Wang B., Liu J., Liu H., Huang D. and others// Systems Biotechnology. – 2015. - Vol. 24. – P.949-963.
17. Sinha R. Studies on process optimization methods for rapamycin production using Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 /Sinha R., Singh S., Srivastava P.// Bioprocess Biosyst Eng. - 2014. - Vol.37. – P.829-840.
18. Dutta S. Kinetics of rapamycin production by Streptomyces hygroscopicus MTCC 4003 / Dutta S., Basak B., Bhunia B., Chakraborty S. and others// Biotechnology. - 2014. – Vol.4. - 523-531.
19. Javorskij V.A. Planirovanie nauchnogo eksperimenta i obrabotka eksperimental’nych dannych [Planning for scientific experiments and experimental data processing]. / Javorskij V.A //M: Izdatel’stvo MFTI. - 2006.
20. Adler Ju.P. Planirovanie eksperimenta prj poiske optimal’nych uslovij [Planning experiments in finding the optimal conditions]. / Adler Ju.P.// M: Nauka. - 1976. – P. 80-92. [in Russian]
21. Hamhanov K.M. Osnovy planirovanija eksperimenta. Metodicheskoe posobie [Basics of experimental design. Toolkit]. /Hamhanov K.M.// Izdatel’stvo: VSGUTU. - 2001. – 94p. [in Russian]
22. Zhernosekova I.V. Metody planirovanija eksperimentov pri optimizacij pitatel’noi sredy dlja streptomiceta. [Methods of experimental design in the optimization of the culture medium for Streptomyces] /Zhernosekova I.V., Chernogor N.P., Tymchuk A.A. and others// Vestnik Dnepropetrovskogo universiteta [Bulletin of Dnepropetrovsk University]. - 2006. – №18 (1). - P.20-28. [in Russian]
23. Bochkarev V.V. Optimizacija chimiko-tehnologicheskih processov. [Optimization of chemical-engineering processes] /Bochkarev V.V., Trojan A.A//. Practikum. Izdatel’stvo TPU [Workshop publishing TPU]. - 2016. – 160p. [in Russian]