AN EXPERIMENTAL STUDY OF THE EFFECT OF SOME NON-STEROIDAL ANTI-INFLAMMATORY DRUGS ON THE ACTIVITY OF MITOCHONDRIAL ENZYMES IN A MODEL OF ALZHEIMER'S DISEASE
AN EXPERIMENTAL STUDY OF THE EFFECT OF SOME NON-STEROIDAL ANTI-INFLAMMATORY DRUGS ON THE ACTIVITY OF MITOCHONDRIAL ENZYMES IN A MODEL OF ALZHEIMER'S DISEASE
Abstract
Nowadays, one of the most popular groups is non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). The elative target population of prescribing these drugs is elderly people, age patients, who use NSAIDs often enough and for a long time, which made it possible to think about analysing and searching for the relationship between NSAIDs and Alzheimer's disease. The scientific observations made verbalized the relationship between Alzheimer's disease and NSAIDs, and hypothesized the novelty of the therapeutic perspective. To this end, the effect of NSAIDs on the activity of mitochondrial enzymes (aconitase, citrate synthase and alpha-ketoglutarate dehydrogenase) in the hippocampus of experimental animals in a model of Alzheimer's disease was examined. Drugs from the group of non-steroidal anti-inflammatory drugs: indomethacin, ibuprofen, celecoxib, nemisulide and acetylsalicylic acid were chosen for the study.
1. Введение
В современном мире одна из самых востребованных групп отпускаемых в аптеке по рецепту и без рецепта – это нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП)
. Часто отпуск данной группы сопряжен не только с назначением врача, но и с ответственным самолечением, которое выбирает для себя сам человек. Актуальность и феноменальный спрос потребителей продиктованы полимодальной активностью, способностью ослаблять проявления «типовых» патофизиологических расстройств (болевая реакция, воспалительный синдром), понятность и доступность применения для пациента. Обширная номенклатура как оригинальных, так дженерических препаратов позволяет клиническим специалистам подобрать наиболее эффективный препарат в зависимости от степени проявления деструкций патологического процесса. Свыше трех десятков миллионов каждый год используют НПВП, 50% этих людей имеют возраст старше 60 лет, потому что у пожилых пациентов чаще и острее проявляются скелетно-мышечные, нейрогенные, воспалительные и другие виды боли . Мировые прогнозы говорят, только о возрастании потребности человечества в этой группе по мере общего старения населения в развитых странах мира. Ввиду того, что НПВП назначаются и применяются пожилыми людьми достаточно часто и отчасти продолжительно создались предпосылки для анализа и поиска связи между приемом нестероидных противовоспалительных средств и болезнью Альцгеймера , , . В какой-то мере первые исходные эмпирические наблюдения были случайны и хаотичны. Но со временем детальное изучение и фиксирование результатов терапии привели многих авторов к пониманию того, что низкая частотность болезни Альцгеймера наблюдается у пациентов, принимающих с целью обезболивания препараты из группы нестероидных противовоспалительных по сравнению с показателями из общей популяции. Последующие научные наблюдения более конструктивно сформулировали взаимосвязь болезни Альцгеймера и НПВП и выдвинули гипотезу о новации терапевтической перспективы , , .2. Цель, методы и принципы исследования
С этой целью вызвало интерес проведение исследования влияния НПВП на активность митохондриальных ферментов (аконитазы, цитратсинтазы и альфа-кетоглутаратдегидрогеназы) в гиппокампе экспериментальных животных при моделировании болезни Альцгеймера
. Для изучения были выбраны препараты из группы нестероидные противовоспалительные: индометацин, ибупрофен, целекоксиб, немисулид и ацетилсалициловая кислота.Условия содержания экспериментальных животных отвечало регламентирующим правилам GLP (good laboratory practice) от 01.03.2010 РФ и Приказу МЗ РФ № 267 от 29.03.2003 г.
.Дизайн исследования:
Крысы (линия Wistar), масса одного животного в пределах 240-260 грамм.
Моделирование болезни Альцгеймера: в гиппокамп (сектор СА1, по разделению Lorente de No) было произведено введение раствора, содержащего фрагмент бета-амилоида 1-42 (2мкл, концентрация 1ммоль/л), предварительно охлажденного (фосфатно-солевой буфер, рН=7,4) при постоянном плавном перемешивании (36ч), доводя до состояния белковых структур (фибриллярные агрегаты)
. Экспериментальных животных подвергали наркотизированию (хлоралгидрат, в/б, 350мг/кг), область темени скальпировалась и вводился фрагмент бета-амилоида 1-42 (5мкл). В дальнейшем, спустя 5 минут игла микродозатора извлекалась, скальпированная часть темени зашивалась и обрабатывалась раствором для наружного использования (10% поливинилпирролидон йод).Сформированы группы:
Контроль, представлял собой группу экспериментальных животных с моделированной патологией не получавших исследуемые препараты, а только эквивалент физиологического раствора.
Ложнопрооперированные – группа экспериментальных животных, подвергшихся оперативным манипуляциям, но без моделирования патологии.
- Индометацин 4,2 мг/кг.
- Ибупрофен 34,2 мг/кг.
- Целекоксиб 8,6 мг/кг.
- Нимесулид 8,6 мг/кг.
- Ацетилсалициловая кислота 8,6мг/кг.
Исследуемые препараты вводили «per os» курсом 60 дней от начала моделирования болезни Альцгеймера.
По истечении 60 дней гиппокамп извлекался, гомогенизировался и центрифугировался с целью выделения фракции митохондрий.
Продуктивность исследуемой фракции митохондрий проводили по анализу содержания цитратсинтазы, аконитазы и альфа-кетоглутаратдегидрогеназы.
О продуктивности альфа-кетоглутаратдегидрогеназы судили по выраженности восстановительной реакции никотинамидадениндинуклеоти́да (340 нм), при участии тиаминпирофосфата и альфа-кетоглутарата. Продуктивность аконитазы изучали так же благодаря спектрофотометрическому методу (340 нм), посредствам определения никотинамидадениндинуклеотидфосфа́та, который образовался в ходе сопряжения аконитаза-изоцитратдегидрогеназной реакции. Продуктивность цитратсинтазы оценивалась спектрофотометрически обнаружением соединений окрашивания регресс-реакции 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислоты при участии ацетил-коэнзим А и оксалоацетата (412 нм).
Методология статистической обработки учитывала вариацию (пакет программ Statistika 6,0): тест Шапиро- Уилка (нормальная сегрегация при распределении результатов); пост-тест Ньюмена-Кейсла (нормальная сегрегация при распределении результатов в условиях значимых статистических отличий); тест Левена (однородность дисперсий).
Вся экспериментальная модуляция регламентировалась предписанием 2010/63/EU
.3. Основные результаты и обсуждение
Есть несколько теорий формирования патологических отклонений и дегенеративных изменений нейрональной системы мозга , . Выделяют преимущественно: искажения метаболического обмена амилоида (амилоидный путь), вследствие преобладания патологической деформации протекания воспалительной реакции. Сам по себе амилоид (амилоидные фибриллы) естественный элемент клеточной плазматической мембраны, но под влиянием альфа и бета секретаз возможен деструктивный каскад, который завершается клеточным апоптозом , , , .
В патогенезе деструктивного воспаления основная роль отводится ферменту циклооксигеназе (ЦОГ), которая может быть конституционной, так называемой ЦОГ-1, для физиологической потребности восполнения синтеза простагландинов, но при возрастании концентрации в очаге патологии синтезируется ЦОГ-2, усугубляющая тяжесть протекания воспалительного ответа. Поэтому вполне закономерно рассматривать группу нестероидных противовоспалительных препаратов как возможность повлиять на течение болезни Альцгеймера.
Полученные экспериментальные данные говорят о заметном снижении инициативности цитратсинтазы, аконитазы и альфа-кетоглутаратдегидрогеназы во фракции митохондрий гиппокампа крыс группы «контроль» как относительно экспериментальных групп, так и относительно группы ложнопрооперированных крыс. Продуктивность цитратсинтазы повысилась при введении индометацина на 26,5%, ибупрофена на 19,1%, ацетилсалициловой кислоты на 25,0%, немисулида на 8,8% и целекоксиба на 5,8% относительно контрольной группы. Продуктивность аконитазы возросла при введении индометацина, ибупрофена, ацетилсалициловой кислоты, немисулида на 200% и целекоксиба на 150% относительно контрольной группы. Каталитические функции альфа-кетоглутаратдегидрогеназы стали более продуктивны при введении индометацина на 40,3%, ибупрофена на 42,6%, ацетилсалициловой кислоты на 42,4%, целекоксиба на 35,0% и немисулида на 31,8% относительно контрольной группы.
Предполагаемый механизм действия стимуляции активности митохондриального матрикса ферментов связан со способностью НПВП сдвигать биохимические процессы воспалительного ответа в сторону подавления динопростона (простагландина Е2) и влиять на гамма-секретазу, что соответственно угнетает образования амилоидного белка (Аβ-42) или сдерживать формирование складчатой–β структуры , , . Наиболее выраженный эффект наблюдается при введении ацетилсалициловой кислоты, индометацина и ибупрофена. Это действие на модулярно-нейромедиаторные системы мозга обусловлено предположительно неселективным ингибированием циклооксигеназы. Перспективность благоприятного терапевтического эффекта при болезни Альцгеймера у ацетилсалициловой кислоты более выражена, предположительно потому что в качестве антиагреганта данный препарат назначается пожилым людям превентивно, для поддержания физиологичной работы сердечно-сосудистой системы в малых дозах продолжительным курсом. Что касается немисулида и целикоксиба, то они подавляют в большей степени циклоокигеназу 2, угнетая синтез простагландинов. Возможно, для более выраженного терапевтического эффекта по предотвращению дегенерации нейронов мозга следует рассмотреть более длительное назначение в малых дозах.
Таблица 1 - Влияние исследуемых веществ на активность тканевых митохондриальных ферментов гиппокампа крыс
Группа животных | Цитратсинтаза Ед/мг белка | Аконитаза Ед/мг белка | Альфа-кетоглутаратдегидрогеназа Ед/мг белка |
Ложнопрооперированные | 22,6±0,7 | 1,4±0,02 | 255,9±6,7 |
Контроль | 6,8±1,0 | 0,2±0,01 | 52,6±9,5 |
Индометацин | 8,6±0,5#* | 0,6±0,03#* | 73,8±11,2#* |
Ибупрофен | 8,1±0,3# | 0,6±0,02* | 75,0±9,4 |
Целекоксиб | 7,2±0,9* | 0,5±0,04# | 71,5±7,3* |
Немисулид | 7,4±0,7 | 0,6±0,03 | 69,3±11,2# |
Ацетилсалициловая кислота | 8,5±0,6#* | 0,6±0,04#* | 74,9±7,9#* |
Примечание: экспериментальная болезнь Альцгеймера; # р<0,05, относительно группы ложнопрооперированных; *р<0,05, относительно группы контроля
Активность фермента цитратсинтазы изменилась при введении индометацина и ацетилсалициловой кислоты в 0,7 раз, у ибупрофена в 0,8 раз, у целекоксиба и немисулида в 0,9 раз в сравнении с контрольной группой. В контрольной группе прослеживается снижением активности митохондриальных ферментов.
Активность аконитазы изменилась при введении индометацина, ацетилсалициловой кислоты, ибупрофена и немисулида в 0,3 раза, целекоксиба 0, 4 раза в сравнении с контрольной группой.
Активность фермента альфа-кетоглутаратдегидрогеназы изменилась примерно одинаково при ведении всех исследуемых препаратов в 0,7 раз в сравнении с контрольной группой.
Во всех экспериментальных группах, а особенно в группе контрольной в сравнении с группой ложнооперированных экспериментальных животных наблюдалось снижение активности анализируемых ферментов.
4. Заключение
Сложность выстраивания четкого клинического патогенеза развития болезни Альцгеймера связана с мультифакторностью вовлечения в дегенеративно-деструктивный процесс клеток головного мозга разнообразных функционалов нервной системы
, . И с позиции предотвращения нарушения перекисного окисления (образования свободных травмирующих радикалов) липидов в процессе воспалительных реакций (как типовых, так и патологичных) посредствам подавления синтеза циклооксигеназы и динопростона, повышение активности цитратсинтазы и альфа-кетоглутаратдегидрогеназы закономерно рассматривать НПВП , , , . Проведенное экспериментальное исследование показало, что группа НПВС способна влиять на биохимических процессы, связанные с активностью митохондриальных ферментов, а именно повышать инициативность в сравнении с группой экспериментальных животных, не получивших фармакологическое содействие при моделированной патологии. Предположительно можно высказать заключение, что малые дозы длительного приема ацетилсалициловой кислоты в качестве антиагреганта для профилактики сердечно-сосудистых патологий способны снижать риски развития болезни Альцгеймера у пожилых пациентов. Но важно отметить, что данное направление в терапии является новым и требует дополнительных исследований.