AN EVALUATION OF THE COMBINED ACTION OF WATER-SOLUBLE VITAMINS AND LYSOZYME
AN EVALUATION OF THE COMBINED ACTION OF WATER-SOLUBLE VITAMINS AND LYSOZYME
Abstract
The article presents the results of an evaluation of the combined action of different concentrations of water-soluble vitamins B1 (thiamine) and C (ascorbic acid) with lysozyme against Micrococcus luteus. The diffusion method was used in the work to estimate the action of the compounds. It is shown that some concentrations of thiamine and ascorbic acid along with their own antimicrobial activity can enhance the lytic effect of lysozyme. The detected synergistic activity of water-soluble antioxidant vitamins with lysozyme may serve as a subject for further study of their use to combat infectious diseases as an auxiliary antibacterial component with preparations containing lysozyme.
1. Введение
Проблема формирования устойчивости микроорганизмов к антибиотикам приобретает все большие масштабы. В связи с этим ведётся разработка новых подходов к лечению и профилактике инфекционных заболеваний. В настоящее время поиск антибактериальных препаратов является актуальной задачей современной медицины во всем мире. Это, безусловно, необходимое, перспективное и, вместе с тем, трудоёмкое и долгосрочное направление. Синтез новых или модифицированных молекул сопровождается существенными финансовыми затратами и не всегда решает проблему. В литературе последних лет все чаще появляются публикации о возможном применении уже известных препаратов для изменения патогенного потенциала или полного подавления микрофлоры при заболеваниях микробного генеза . С этих позиций представляют интерес витамины, в частности витамины С и B1 – сложные химические соединения, значимость которых для организма не вызывает сомнения. Известно, что витамин С (аскорбиновая кислота) способствует повышению устойчивости организма при инфекционных заболеваниях. При С-авитаминозе наблюдается особое предрасположение к любым инфекциям, в частности, к пневмониям, вследствие снижения резистентности организма . Биологическая роль витамина С в основном связана с его участием в реакциях гидроксилирования, где он является донором водорода. Аскорбиновая кислота, или аскорбат, обладает антиоксидантным действием, участвует в биосинтезе специфических соединительнотканных белков: коллагена и эластина, входящих в состав хрящей, костей и стенок сосудов. Сходным действием обладает и тиамин, выступая как антиоксидант, защищая организм от разрушительных воздействий. Известно, что B1-витаминная недостаточность снижает сопротивляемость организма к некоторым хроническим инфекциям. Вместе с тем есть сведения о непосредственном влиянии водорастворимых витаминов на отдельные патогенные, условно-патогенные и пробиотические микроорганизмы . Установлено, что витамины в определенных концентрациях могут стимулировать рост одних и – ингибировать рост других бактерий. Растворы витаминов способны оказывать влияние на резистентность микроорганизмов к антибиотикам . При этом, в литературе недостаточно освещен эффект применения водорастворимых витаминов в сочетании с антимикробными агентами. В частности, известно, что в комплексе с лизоцимом аскорбиновая кислота создает оптимальную кислотность среды, способную разрушить бактериальные клетки , . В клинической практике хорошо зарекомендовали себя в лечении гнойно-воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей комбинированные препараты естественного лизоцима с пиридоксином (витамином В6), и с аскорбиновой кислотой , . В стоматологической практике все чаще внедряют соли аскорбиновой кислоты в различных концентрациях . Успешная практика сочетания различных терапевтических препаратов с витаминами послужила основанием для нашего исследования.
Цель исследования – оценка сочетанного действия лизоцима и различных концентраций водорастворимых витаминов В1 и С на тест-культуру M. luteus.
2. Методы и принципы исследования
Объектом исследования была тест-культура Micrococcus luteus (lysodeikticus) ATCC 4698. Данный микроорганизм был выбран в качестве мишени, учитывая его известную чувствительность к лизоциму. Культивирование микроорганизма проводили на ГРМ-агаре (Оболенск, Россия). В работе использованы витамин В1 (ОАО «Борисовский завод медицинских препаратов», Республика Беларусь), витамин С (Армавирская биологическая фабрика, Россия), яичный лизоцим (Fluka BioChemika, Бельгия). Изучено действие следующих концентраций витамина В1 и витамина С 50 мг/мл, 5 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,005 мг/мл, 0,005 мг/мл. Оценивалась литическая активность лизоцима в концентрациях 175 мг/мл, 87,5 мг/мл, 17,5 мг/мл, 1,75 мг/мл, 0,175 мг/мл. Разведения изучаемых соединений готовили на стерильном растворе 0,9 % NaCl.
Исследование выполнено по методикам , . Лунки в агаре вырезали специальным пробойником диаметром 3 мм. В лунки с помощью дозатора вносили по 50 мкл растворов, используемых в эксперименте (контроль – физиологический раствор, опыт – изучаемые концентрации лизоцима, витамина В1 (тиамина), витамина С (аскорбиновой кислоты), раствор лизоцима с добавлением разных концентраций витамина В1, раствор лизоцима с добавлением разных концентраций витамина С). Чашки инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста. Результаты учитывали в мм, по величине диаметра зоны подавления роста микроорганизмов вокруг лунок.
Все эксперименты были выполнены в трех повторах. Статистический анализ проводили с использованием программ Past, Microsoft Exel, Statistica. Данные представлены как среднее ± SD (стандартное отклонение). Значимость различий между контролем и вариантами эксперимента определяли с использованием метода множественных сравнений Даннета. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
3. Основные результаты
Рисунок 1 - Степень литической активности лизоцима против M. luteus
Рисунок 2 - Влияние витаминов на рост M. luteus
Рисунок 3 - Влияние сочетанного действия витаминов и лизоцима на рост M. luteus
4. Обсуждение
Результаты исследования показали, что лизоцим предсказуемо оказывал литическое действие на чувствительную к нему тест-культуру микроорганизмов. Вместе с тем, выяснилось, что и концентрации водорастворимых витаминов В1 и С при разведении на два и даже три порядка оказывают в эксперименте ингибирующее действие на тест-культуру Micrococcus luteus. Обнаруженный антибактериальный эффект витаминов согласуется с известными данными о способности аскорбиновой кислоты (С) и тиамина (B1) задерживать рост грамположительных бактерий, а именно, Staphylococcus aureus , . Совместное использование лизоцима и водорастворимых витаминов B1 и С, оказывало синергидный антибактериальный эффект, причём более наглядно это проявлялось при комбинации лизоцима с тиамином. Обнаруженный факт укладывается в парадигму одной из стратегий усиления антибактериального эффекта уже известных лекарственных средств сочетанием двух и более биологически активных веществ , . Учитывая, что обнаруженный синергидный эффект изучаемые витамины оказывали in vitro в концентрациях, превышающих таковую в организме, перспективным представляется оценить возможность их использования как вспомогательный антибактериальный компонент для наружного применения.
5. Заключение
Проведенные исследования показали возможность расширения использования разных концентраций водорастворимых витаминов B1 и С в сочетании с лизоцимом для эффективной борьбы с бактериальными инфекциями. Это позволяет считать исследование перспективным и даёт основание для проведения дальнейших экспериментов с целью оптимизации схемы практического использования.