INFLUENCE OF SCD1 (STEROL-CoA DESATURASE) AND AGPAT6 (1-ACYLGLYCERYL-3-PHOSPHATE-O-ACYLTRANSFERASE) GENES POLYMORPHISMS ON CONTENT AND FAT COMPOSITION OF MILK FAT IN GOLSTINIZED BLACK-AND-WHITE COWS
INFLUENCE OF SCD1 (STEROL-CoA DESATURASE) AND AGPAT6 (1-ACYLGLYCERYL-3-PHOSPHATE-O-ACYLTRANSFERASE) GENES POLYMORPHISMS ON CONTENT AND FAT COMPOSITION OF MILK FAT IN GOLSTINIZED BLACK-AND-WHITE COWS
Abstract
The aim of this work was to evaluate the frequencies of allelic polymorphisms of SCD1 (Sterol-CoA desaturase) and AGPAT6 (1-Acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferase) genes and their correlation with animal performance indicators (milk yield, fat and protein content) and fatty acid composition of milk. The studies were carried out on Holsteinised black-and-white cows of the experimental farm (n=310). Allelic polymorphism of SCD1 and AGPAT6 genes was evaluated using real-time polymerase chain reaction. The allele frequencies of T and C alleles of SCD1 gene rs41255693, were 0.17 and 0.83, respectively, and the allele frequencies of G and T alleles of AGPAT6 gene rs 211250281 were 0.54 and 0.46, respectively. No significant differences in daily milk yield from genotypes were obtained. Allele C of SCD1 gene and allele G of AGPAT6 gene, had a positive effect (P≤0.001) of milk fat content. In terms of fatty acid content, animals with the ST and CC genotypes of the SCD1 gene were superior to animals with the TT genotype (P≤0.001), except for the trans-isomers of fatty acids, where the opposite situation was observed. In the case of the AGPAT6 gene, the predominance of fatty acids was observed in the GG and GT genotypes, except for trans-isomers, where the minimum values were observed in the GT genotype.
1. Введение
Молочный жир является сложносоставным продуктом состоящим из фосфолипидов, холестерина, ди- и триацилглицеридов. Триацилглицериды (TAG) составляющие основную массу жира и являясь производным глицерина и трех жирных кислот, синтезируется в молочной железе либо de novo, либо поступают из плазмы крови . Функции и характеристики TAG зависят от доступности жирных кислот присутствующих в эпителиальных тканях молочной железы. В молочном жире насчитывается свыше 400 жирных кислот, но только 15-20 из них представлены в количествах превышающие 1% от общего содержания липидов и варьируют от С4 до С18, а также включают насыщенные, моно-и полиненасыщенные жирные кислоты . Так жирные кислоты с короткой и средней цепью от С4 до С16 синтезируются de novo в молочной железе, тогда как остальные ЖК поступают из плазмы крови , липидный состав в определенной степени передается по наследству. Наследуемость содержания жирных кислот в молоке колеблется в диапазоне от 0,2 до 0,4 для насыщенных ЖК, а для таких кислот как C6:0, C8:0, C10:0 и C14:0 даже превышает указанные значения . У крупного рогатого скота генетическими исследованиями с применением GWAS-анализа, выявлены многочисленные области генома отвечающие за ассоциации с количественными признаками (QTL), но для состава и содержания жирных кислот в молоке, обнаружены только единичные гены. Значимые ассоциации в ранних исследованиях были получены для областей QTL располагающиеся на 26 и 27 хромасомах , что соответствуют генам SCD1 (Стерол-CoA десатураза 1), и AGPAT6 (1-ацилглицерин-3-фосфат-O-ацилтрансфераза). Для гена SCD1 в ряде исследований была установлена взаимосвязь с содержанием средне- и длиноцепочечных ненасыщенных жирных кислот, в частности с С14:0, С14:1 и С16:0, С16:1 у голштинов и симменталов разводимых в Италии , а также определены шесть однонуклеотидных замен, располагающиеся как и в кодирующих областях, так и в интронных, из которых была отмечена SNP c.878C>T в 3-м экзоне, приводящая к замене аланина на валин в белковой цепи . Для AGPAT6 была показана регуляторная функция в процессе синтеза липидов, т.к. он входит в семейство ферментов ацилглицерофосфатацилтрансферазы (AGPAT), при этом являясь наиболее экспрессируемым из всех генов входящих в QTL на 27 хромосоме . Нокаут AGPAT6 приводит к значительному снижению концентраций TGA в эпителиальных клетках молочной железы у коров и буйволов, а также снижению уровня экспрессии мРНК генов SCD1, DGAT1, PLIN2, что приводило к снижению количества жира и размеру липидных капель в молоке . На основании вышеизложенного целью нашей работы является оценка уровня полиморфизма генов SCD1 и AGPAT6 в популяции крупного рогатого скота голштинизированной черно-пестрой породы и влияние их на продуктивные показатели и жирнокислотный состав молока.
2. Методы и принципы исследования
Исследования проводились на животных голштинизированной черно-пестрой породы (n=310) (опытное хозяйство ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им.Л.К.Эрнста, Краснодарский край). Геномная ДНК выделялась с использованием набора «ДНК-Экстран-2» производства НПО «СИНТОЛ» из выщипов ушных раковин.
Реакцию амплификации проводили в 20 мкл смеси ПЦР, содержащей 5 мкл реактива qPCRmix-HS («Евроген», Россия), по 1 мкМ прямого и обратного праймеров, по 0,5 мкМ аллель-специфичных ДНК-зондов (Таблица 1) и10 нг ДНК.
Таблица 1 - Последовательности используемых олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зондов
AGPAT6 rs 211250281 | |
AGPAT6-F: 5′-CCAGAAAGGCTGGAGGAGTT-3′ AGPAT6-R: 5′-ATTCCCAGAAGCACAGTTTAGT T-3′ AGPAT6_G: 5′-FAM-CAAGAAAATGTGACGGTA-BHQ1-3′ AGPAT6_T:5′-HEX-CAAGAAAATTTGACGGTAT-BHQ1-3′ | |
SCD1 rs41255693 | |
SCD1-F: 5'- CCCTTATGACAAGACCATCAACC -3' SCD1-R: 5'-GACGTGGTCTTGCTGTGGACT -3' SCD1-T:5'-FAM- CTTACCCACAGCTCCCA-BHQ1-3' SCD1-С: 5'HEX-TACCCGCAGCTCCC-3- BHQ1 |
ПЦР в «реальном времени» проводим с помощью прибора Bio-Rad CFX96 в оптимизированных условиях (95 °C - 10 мин.; 95 °C - 20 сек., 55 °C - 30 сек., 72 °C 20 сек., 40 циклов). Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и HEX. Аллельная дискриминация оценивалась посредством программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager.
В исследовании учитывались следующие показатели: суточный удой (кг), массовая доля жира/белка в молоке (%), содержание казеинов (%), жирнокислотный состав молока (г/100г): С14, С16, С18, С18.1, LCFA, MCFA, MUFA, PUFA, SFA, SCFA, TFA. Данные о фракционном составе молока получали посредством индивидуального отбора проб молока во время проведения ежемесячных контрольных доений – 3 раза в сутки (утро-день-вечер) и последующего анализа в лаборатории селекционного контроля качества молока ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста на автоматическом анализаторе CombiFoss 7 DC («Foss», Дания) в период с июня 2020 по июль 2022 гг. В исследовательскую базу вошли 10243 наблюдения за период проведения исследования.
Описательные статистические параметры (среднее арифметическое, ошибка, стандартное отклонение) вычислялись при помощи пакета «Анализ данных» в среде MSExcel 2013.
3. Основные результаты
Применение метода ПЦР в режиме реального времени позволило значительно ускорить процесс постановки анализа и упростить интерпретацию результатов реакции. Амплификация каждого аллеля чётко отображалась в соответствующем канале детекции. Для каждого животного были идентифицированы все генотипы обоих исследуемых генов SCD1 и AGPAT6 (Таблица 2).
Таблица 2 - Частоты аллелей и генотипов генов SCD1 и AGPAT6 у голштинизированного черно-пестрого скота опытного хозяйства
| Частоты генотипов | Частоты аллелей | χ2 | p-value | |||
SCD1 | TT | TC | CC | T | C | 5,08 | 0,08 |
0,05 | 0,24 | 0,71 | 0,17 | 0,83 | |||
AGPAT6 | GG | GT | TT | G | T | 0,3 | 0,86 |
0,28 | 0,51 | 0,21 | 0,54 | 0,46 | |||
В рамках исследуемой выборки голштинизированных черно-пестрых коров выявлена очень низкая частота встречаемости аллеля Т (0,17) и соответственно крайне низкая частота встречаемости генотипа ТТ (0,05) SNP rs41255693 гена SCD1, с частотой гетерозигот (Ho) 0,24. Частоты встречаемости аллелей G и Т SNP rs211250281 гена AGPAT6 распределялись равномерно по выборке и составили 0,54 и 0,46, соответственно, с частотой гетерозигот (Ho) 0,51. Отклонений фактического распределения частот генотипов от теоретического согласно закону Харди-Вайнберга не наблюдалось.
Особенность низкой частоты встречаемости аллеля Т SNP rs41255693 гена SCD1, рядом авторов объясняется породоспецифичностью, что соответствует ряду исследований которые показали, аналогичные результаты у голштинской породы. Так для датских голштинов разводимых в Нидерландах в 2008 г. частоты встречаемости аллеля Т и генотипа ТТ составили 0,07 и 0,27, соответственно, с частотой гетерозигот (Ho) 0,4 , в 2012 году для голштинов разводимых в Китае, продемонстрированы аналогичные результаты с частотами аллелей С (0,789) и Т (0,211) , тот же результат был получен в 2020 на польских голштинах . При этом в более ранних исследованиях на польских голштинах, а также на датских были получены полностью противоположные результаты и аллель С имел низкую частоту встречаемости – 0,32 и 0,27 . Хотя преобладание аллеля Т у европейского скота скорее исключение, т.к. согласно многочисленным зарубежным исследованиям на разнообразных породах было показано превалирование аллеля С над Т. Так для голштинов разводимых в Европе , , , Азии и Южной Америке частоты встречаемости аллеля С варьировались в диапазоне от 0,57 до 0,65. Аналогичные результаты были получены и отечественными исследователями на первотелках голштинской породы – СС (0,384), СТ (0,457), ТТ (0,159) . Высокая частота встречаемости аллеля С SNP rs41255693 гена SCD1 также показана и у других молочных пород: айширская (0,858) , итальянская бурая (0,82) , джерсейская (0,81), чилийская Фрисон Негро (0,89) и оверо колорадо (0,92) . Умеренные частоты встречаемости были показаны для мясных пород скота и варьировали в диапазоне от 0,77 у герефордов до 0,52 у коррейского мясного скота Hanwoo , , , . Обратная ситуация характерна для аборигенных пород скота, что продемонстрировано в исследованиях на индонезийском аборигенном скоте, где частота аллеля Т составила 0,75 , а для африканских пород Borgou и White Fulani – 0,84 и 0,94 , соответственно. При этом в исследованиях на бразильском зебувидном скоте породы Гир, аллельный полиморфизм выявлен не был и все животные были представлены генотипом СС .
В промоторной области гена AGPAT6 выявлено несколько SNP: rs211250281, rs378026790, rs211036538, rs209855549 , но на текущий момент данных о полиморфизме данных SNP очень мало. Полученные нами частоты у голштинизированного черно-пестрого скота полностью соответствовали ранее проведенным исследованиям, а данные по другим породам показывают, что частоты колебались в диапозоне от 0,125/0,875 (айширская) до 0,463/0,537 (абердин-ангусская) для аллеля Т и G, соответственно .
Данные о показателях молочной продуктивности и жирнокислотном составе молока представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Среднее, минимальное и максимальное значение, коэфициент вариации показателей продуктивности и жирнокислотного состава молока
Показатель | Средняя | Мин. | Макс. | CV, % |
Суточный удой | 23±0,07 | 1 | 48 | 31,11 |
МДЖ% | 3,96±0,01 | 0,59 | 12,05 | 27,63 |
МДБ% | 3,51±0,005 | 2,19 | 6,14 | 13,01 |
Казеин | 2,8±0,004 | 1,43 | 5,05 | 14,64 |
Миристиновая (С14:0) | 0,4±0,001 | 0,12 | 1,17 | 28,41 |
Пальмитиновая (С16:0) | 0,95±0,002 | 0,23 | 3,16 | 29,02 |
Стеариновая (С18:0) | 0,33±0,001 | 0 | 1,21 | 35,07 |
Олеиновая (С18:1) | 1,15±0,003 | 0,13 | 5,07 | 29,26 |
Длинноцепочечные (LCFA) | 1,43±0,005 | 0 | 6,18 | 31,92 |
Среднецепочечные (MCFA) | 1,5±0,004 | 0,33 | 4,82 | 28,97 |
Мононенасыщенные (MUFA) | 1,11±0,003 | 0,23 | 5,01 | 28,91 |
Полиненасыщенные (PUFA) | 0,13±0,0003 | 0 | 0,35 | 24,97 |
Насыщенные (SFA) | 2,53±0,007 | 0,38 | 7,4 | 29,22 |
Короткоцепочечные (SCFA) | 0,51±0,002 | 0,02 | 1,5 | 31,94 |
Трансизомеры (TFA) | 0,09±0,0004 | 0 | 0,39 | 44,85 |
В жирнокислотном составе молока наибольшее распространение среди индивидуальных жирных кислот имела олеиновая кислота (С18:1), а среди групп – насыщенные жирные кислоты (SFA). Наибольшая изменчивость наблюдалась у трансизомеров жирных кислот (TFA) – 44,85%. Влияние аллельного полиморфизма изучаемых генов на молочную продуктивность и жирнокислотный составмлока представлено в таблице 4.
Таблица 4 - Показатели молочной продуктивности и жирнокислотного состава молока в зависимости от аллельного полиморфизма SNP rs41255693 гена SCD1 и SNP rs211250281 гена AGPAT6
Показатель | SCD1 | AGPAT6 | ||||
CC | TC | TT | TT | GT | GG | |
Суточный удой | 23,28 ±0,09 | 23,54 ±0,14 | 23,35 ±0,39 | 23,78 ±0,15 | 23,05 ±0,10 | 23,66 ±0,14 |
МДЖ% | 3,96 ±0,01 | 4,04 ±0,02 | 3,57 ±0,04 | 3,86 ±0,03 | 3,95 ±0,02 | 4,07 ±0,02 |
МДБ% | 3,52 ±0,005 | 3,51 ±0,009 | 3,48 ±0,02 | 3,51 ±0,01 | 3,50 ±0,01 | 3,53 ±0,01 |
Казеин | 2,82 ±0,005 | 2,82 ±0,01 | 2,77 ±0,02 | 2,81 ±0,01 | 2,81 ±0,01 | 2,83 ±0,01 |
Миристиновая (С14:0) | 0,39 ±0,001 | 0,41 ±0,002 | 0,35 ±0,004 | 0,39 ±0,002 | 0,39 ±0,002 | 0,40 ±0,002 |
Пальмитиновая (С16:0) | 0,95 ±0,003 | 0,97 ±0,005 | 0,82 ±0,01 | 0,91 ±0,006 | 0,95 ±0,004 | 0,98 ±0,005 |
Стеариновая (С18:0) | 0,33 ±0,001 | 0,33 ±0,002 | 0,30 ±0,005 | 0,31 ±0,002 | 0,32 ±0,002 | 0,34 ±0,002 |
Олеиновая (С18:1) | 1,15 ±0,004 | 1,16 ±0,01 | 1,10 ±0,01 | 1,14 ±0,01 | 1,15 ±0,005 | 1,17 ±0,01 |
Длинноцепочечные (LCFA) | 1,43 ±0,005 | 1,44 ±0,01 | 1,33 ±0,02 | 1,40 ±0,01 | 1,42 ±0,01 | 1,46 ±0,01 |
Среднецепочечные (MCFA) | 1,5 ±0,01 | 1,53 ±0,01 | 1,3 ±0,02 | 1,45 ±0,01 | 1,49 ±0,02 | 1,54 ±0,02 |
Мононенасыщенные (MUFA) | 1,11 ±0,004 | 1,12 ±0,01 | 1,06 ±0,01 | 1,09 ±0,01 | 1,11 ±0,005 | 1,13 ±0,01 |
Полиненасыщенные (PUFA) | 0,126 ±0,0003 | 0,128 ±0,0006 | 0,127 ±0,001 | 0,127 ±0,001 | 0,126 ±0,0004 | 0,128 ±0,001 |
Насыщенные (SFA) | 2,53 ±0,01 | 2,59 ±0,01 | 2,23 ±0,03 | 2,45 ±0,02 | 2,52 ±0,01 | 2,62 ±0,01 |
Короткоцепочечные (SCFA) | 0,50 ±0,002 | 0,52 ±0,003 | 0,45 ±0,01 | 0,49 ±0,003 | 0,50 ±0,002 | 0,52 ±0,003 |
Транс-изомеры (TFA) | 0,090 ±0,0005 | 0,092 ±0,001 | 0,097 ±0,002 | 0,093 ±0,001 | 0,09 ±0,001 | 0,093 ±0,001 |
Для SNP rs41255693 гена SCD1 имеются ряд исследований, оценивающий влияние аллельного полиморфизма на содержание жира и жирных кислот в молоке молочных пород. Так было показано, что животные с генотипом СС превосходят по содержанию жира и белка ТТ животных, с наибольшими показателями племенной ценности у гетерозигот СТ , . В нашем исследовании были получены схожие результаты по содержанию жира (P≤0,001) и белка (Р≤0.001), но достоверных различий по массовой доле белка между генотипами СС и СТ обнаружено не было.
По индивидуальным жирным кислотам рядом исследований была показана ассоциация с повышенным содержанием миристиновой (С14:0), пальмитиновой (С16:0) кислот, а для групп жирных кислот для насыщенных (SFA) и полиненасыщенных (PUFA) кислот, для генотипа ТТ, в тоже время генотип СС превосходил по содержанию мононенасыщенных (MUFA) кислот и стеариновой (С18:0) кислоты , . Нами были получены отличающиеся результаты, по всем индивидуальным и группам жирных кислот, животные с генотипом СТ и СС превосходили (P≤0.001) животных с генотипом ТТ, за исключением PUFA, где перевес был в сторону аллеля Т: +0,001 для генотипа ТТ и +0,002 (P≤0.01) для генотипа СТ, и транс-изомеров (TFA) жирных кислот, где преобладал генотип ТТ (Р≤0.05). Максимальные показатели по содержанию жирных кислот были получены для гетерозиготного генотипа СТ, что может говорить о промежуточной наследственности гена SCD1.
Несмотря на то, что открытие и исследования функций белка 1-ацилглицерол-3-фосфат О-ацилтрансфераза (AGPAT6) ведутся с 2006 года , данные об установления ассоциаций нового гена с продуктивными качествами крупного рогатого скота стали появляться только последние 5-6 лет с применением GWAS-анализа. Хотя и установлено, что данный ген играет значимую роль в регуляции синтеза триацилглицеридов и жирных кислот , данных о влияние полиморфизмов определенных SNP на продуктивность и содержание жирных кислот отсутствуют. Полученные нами результаты свидетельствуют о положительном влиянии аллеля G (P≤0.001) SNP rs211250281 гена AGPAT6 на содержание жира в зависимости от количества аллелей в генотипе. Исследованиями E.Viale (2017) , была показано влияние AGPAT6 на технологические свойства молока, а именно время свертывания под воздействием сычужного фермента, но в нашем исследовании достоверной ассоциации с содержанием белка и казеина обнаружено не было.
Влияние на содержание индивидуальных и групп жирных кислот, показало достоверную ассоциацию с аллелью G для миристиновой (С14:0) (P≤0.01), пальмитиновой (С16:0), среднецепочечных (MCFA), насыщенных (SFA) и короткоцепочечных (SCFA) (P≤0.001) жирных кислот. Стеариновой (С18:0) жирной кислоты было показано преобладание генотипа GT над TT (P≤0.05), но достоверных различий у олеиновой (С18:1) кислоты, а также длинноцепочечных (LCFA), мононенасыщенных (MUFA) кислот обнаружено не было, при этом образцы от животных с генотипом GG превосходили (P≤0.05) остальные генотипы по содержанию данных кислот.
Аналогично с геном SCD1 для полиненасыщенных (PUFA) и транс-изомеров (TFA) жирных кислот, были получены отличимые результаты, так минимальное содержание данных кислот было характерно для генотипа GT (P≤0.001), с отсутствием достоверных отличий у гомозиготных генотипов. Стоит отметить, что TFA получаются путем биогидрогенизации в рубце коровы из PUFA, но в исследуемой выборке данные кислоты были представлены в наименьшем количестве (табл.3). Указанное дает возможность предположить, что данные кислоты больше подвержены влиянию средовых факторов, таких как тип кормления, содержание животных, а не аллельному полиморфизму.
4. Заключение
В нашем исследовании был изучен аллельный полиморфизм генов SCD1 и AGPAT6 и оценено влияние на молочную продуктивность и жирнокислотный состав молока голштинизированных черно-пестрых коров. Частота встречаемости аллелей С и Т для SNP rs41255693 гена SCD1 составили 0,83 и 0,17, соответственно, а для аллелей G и Т SNP rs211250281 гена AGPAT6 – 0,54 и 0,46. Достоверные различия по уровню суточного удоя от генотипов получены не были. На содержание жира и жирных кислот в молоке большее влияние оказывали аллели С гена SCD1 и G гена AGPAT6. Для проведения селекционной работы желательно отбирать животных с генотипами СТ и СС гена SCD1 и гена AGPAT6 генотипы GG и GT. Использование данных о полиморфизмах изученных генов в селекционных программах и при подборах родительских пар способствует улучшению показателей продуктивности животных, а в частности повышению содержания жира в молоке. Однако для того чтобы предложенные гены могли бы использоваться как генетические маркеры хозяйственно-полезных признаков, необходимо более развёрнутое исследование на разводимых в нашей стране пород скота, особенно на отечественных генофондных породах.